分子剋隆實驗指南（第四版平裝版） （美）M.R.格林 科學齣版社 冷泉港實驗室 pdf epub mobi txt 电子书 下载 2025

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[美] MR格林 著，賀福初 譯

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出版社： 科学出版社

ISBN：9787030519979

商品编码：11829104200

包装：平装

出版时间：2017-03-31

页数：1656

字数：3000

商品參數

分子剋隆實驗指南（第四版平裝版）
	曾用價	598.00
	齣版社	科學齣版社
	版次	1
	齣版時間	2017年03月
	開本
	作者	（美）M.R.格林
	裝幀	平裝
	頁數	1656
	字數	3000
	ISBN編碼	9787030519979

內容介紹
分子剋隆技術30多年來一直是全球生命科學領域實驗室專業技術的基礎。冷泉港實驗室齣版社齣版的《分子剋隆實驗指南》一書擁有的可靠性和**性，使本書成為業內*流行、*具影響力的實驗室操作指南。
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目錄
目錄
上冊
第1章 DNA的分離及定量 1
導言 2
方案1 SDS堿裂解法製備質粒DNA：少量製備 9
方案2 SDS堿裂解法製備質粒DNA：大量製備 12
方案3 從革蘭氏陰性菌（如Ecolz中分離DNA 15
方案4 乙醇法沉澱DNA 17
方案5 異丙醇法沉澱DNA 21
方案6 用微量濃縮機進行核酸的濃縮和脫鹽 22
方案7 丁醇抽提法濃縮核酸 23
方案8 聚乙二醇沉澱法製備Ml3噬菌體單鏈DNA 24
方案9 Ml3噬菌體鋪平闆 27
方案10 Ml3噬菌體液體培養 30
方案11 Ml3噬菌體雙鏈（復製型）DNA的製備 32
方案12 利用有機溶劑分離純化高分子質量DNA 35
方案13 用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細胞中分離高分子質量DNA 37
方案14 一步法同時提取細胞或組織中的DNA、RNA和蛋白質 43
方案15 從鼠尾或其他小樣本中製備基因組DNA 46
替代方案：不使用有機溶劑從鼠尾分離DNA 48
替代方案：一管法從鼠尾中分離DNA 49
方案16 快速分離酵母DNA 50
方案17 微型凝膠電泳後使用溴化乙錠(EB)估算條帶中DNA數量 52
方案18 利用Hoechst33258通過熒光分析儀估算DNA濃度 53
方案19 用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
信息欄 56
第2章 DNA分析 62
導言 63
方案1 瓊脂糖凝膠電泳 73
方案2 瓊脂糖凝膠中DNA的染色檢測 76
方案3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 80
方案4 聚丙烯酰胺凝膠中DNA的染色檢測 85
方案5 聚丙烯酰胺凝膠中DNA的放射自顯影檢測 86
方案6 堿性瓊脂糖凝膠電泳 87
附加方案：堿性瓊脂糖凝膠的放射自顯影 90
方案7 成像：放射自顯影和感光成像 91
方案8 用玻璃珠從瓊脂糖凝膠中迴收DNA 96
方案9 低熔點瓊脂糖凝膠中DNA的迴收：有機溶劑抽提法 98
方案10 聚丙烯酰胺凝膠中DNA片段的迴收：壓碎與浸泡法 101
方案11 Southern印跡 103
方案12 Southern印跡：DNA從一塊瓊脂糖凝膠同時嚮兩張膜轉移 110
方案13 采用放射性標記探針對固定在膜上的核酸DNA進行Southern雜交 112
附加方案：從膜上洗脫探針 117
信息欄 119
第3章 質粒載體剋隆與轉化 122
導言 123
方案1 製備和轉化感受態大腸杆菌的Hanahan方法：高效轉化策略 126
方案2 製備和轉化感受態大腸杆菌的Inoue方法：“超級感受態”細胞 131
方案3 大腸杆菌的簡單轉化：納米顆粒介導的轉化 135
替代方案：一步法製備感受態大腸杆菌：在同一溶液中轉化和儲存細菌細胞 136
方案4 電穿7L法轉化大腸杆菌 138
方案5 質粒載體剋隆：定嚮剋隆 143
方案6 質粒載體剋隆：平末端剋隆 145
方案7 質粒DNA的去磷酸化 148
方案8 嚮平末端DNA添加磷酸化銜接子／接頭 150
方案9 剋隆PCR産物：嚮擴增DNA的末端添加限製性酶切位點 151
方案10 剋隆PCR産物：平末端剋隆 154
方案11 剋隆PCR産物：製各T載體 157
方案12 剋隆PCR産物：TA剋隆 159
方案13 剋隆PCR産物：TOPO TA剋隆 161
方案14 使用X-Gal和IPTG篩選細菌菌落：a-互補 165
信息欄 167
第4章 Gateway重組剋隆 205
導言 206
方案1 擴增Gatewav載體 210
方案2 製備可讀框入門剋隆和目的剋隆 213
方案3 應用多位點LR剋隆反應製備目的剋隆 219
信息欄 222
第5章 細菌人工染色體及其他高容量載體的應用 223
導言 224
方案1 BAC DNA的小量分離和PCR檢驗 235
方案2 BAC DNA的大量製備和綫性化 238
方案3 通過脈衝電場凝膠電泳檢驗BAC DNA的質量和數量 241
方案4 兩步BAC工程：穿梭載體DNA的製備 242
方案5 A同源臂(A-Box)和B同源臂(B-Box)的製備 244
方案6 剋隆A和B同源臂到穿梭載體 247
方案7 重組穿梭載體的製備和檢驗 249
方案8 通過電穿7L法轉化重組穿梭載體到感受態BAC宿主細胞 251
方案9 共閤體的檢驗和重組BAC剋隆的篩選 253
方案10 一步BAC修飾：質粒製備 256
方案11 A同源臂(A-Box)的製備 259
方案12 剋隆A同源臂到報道穿梭載體 260
方案13 用RecA載體轉化BAC宿主 263
方案14 轉移報道載體到BACiRecA細胞以及共閤體的篩選 265
方案15 釀酒酵母(S.cerevisiae)的生長和DNA製備 267
方案16 酵母DNA的小量製備 269
信息欄 270
第6章 真核細胞RNA的提取、純化和分析 275
導言 276
方案1 從哺乳動物的細胞和組織中提取總RNA 279
替代方案 從小量樣本提取RNA 281
方案2 從斑馬魚胚胎和成體中提取總RNA 282
方案3 從黑腹果蠅提取總RNA 283
方案4 從秀麗隱杆綫蟲中提取總RNA 285
方案5 從釀酒酵母菌中采用熱酸酚提取總RNA 287
方案6 RNA定量和儲存 289
方案7 RNA的乙醇沉澱 295
方案8 通過無RNase的DNaseI處理去除RNA樣品中的DNA汙染 297
方案9 oligo(dT)磁珠法提取poly(A)+mRNA 298
方案10 按照大小分離RNA：含甲醛的瓊脂糖凝膠電泳 308
方案11 根據分子質量大小分離RNA: RNA的尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 312
方案12 瓊脂糖凝膠中變性RNA的轄膜和固定 319
替代方案 下行毛細管轉移 323
方案13 聚丙烯酰胺凝膠的電轉移和膜固定 325
方案14 Northern雜交 327
方案15 純化RNA的點雜交和狹縫雜交 330
方案16 用核酸酶Sl對RNA作圖 342
方案17 核糖核酸酶保護分析：用核糖核酸酶和放射性標記的RNA探針對RNA作圖 349
方案18 引物延伸法分析RNA 355
信息欄 359
第7章 聚閤酶鏈反應 363
導言 364
方案1 基礎PCR 375
方案2 熱啓動PCR 380
方案3 降落PCR 383
方案4 高GC含量模闆的PCR擴增 385
方案5 長片段高保真PCR (IA PCR) 390
方案6 反嚮PCR 393
方案7 巢式PCR 397
方案8 mRNA反轉錄産物cDNA的擴增：兩步法RT-PCR 400
方案9 由mRNA的5'端進行序列的快速擴增：5'-RACE 409
方案10 由mRNA的3'端進行序列的快速擴增：3 '-RACE 416
方案11 使用PCR篩選剋隆 422
信息欄 424
第8章 生物信息學 431
導言 432
方案1 使用ucsc基因組瀏覽器將基因組注釋可視化 434
方案2 使用BLAST和ClustalW進行序列比對和同源性檢索 444
方案3 使用Primer3Plus設計PCR引物 450
方案4 使用微陣列和RNA-seq進行錶達序列譜分析 461
方案5 將上億短讀段定位至參考基因組上 472
方案6 識彆ChIP-seq數據集中富集的區域（尋峰） 483
方案7 發現順式調控基序 495
信息欄 503
中冊
第9章 實時熒光聚閤酶鏈反應定量檢測DNA及RNA 509
導言 510
方案1 實時PCR反應用引物和探針濃度的優化 532
方案2 製作標準麯綫 537
方案3 實時熒光PCR定量檢測DNA 540
方案4 實時熒光PCR定量檢測RNA 542
方案5 實時熒光PCR實驗數據的分析和歸一化 545
信息欄 550
第10章 核酸平颱技術 551
導言 552
方案1 即製微陣列 560
方案2 Round AiRoundB DNA擴增 564
方案3 核小體DNA和其他小於500bp的DNA的T7綫性擴增(TIAD) 567
方案4 RNA的擴增 572
方案5 RNA的Cvanine-dUTP直接標記 578
方案6 RNA的氨基烯丙基-dUTP間接標記 581
方案7 用Klenow酶對DNA進行Cyanine-dCTP標記 583
方案8 DNA的間接標記 585
方案9 封閉自製微陣列上的多聚賴氨酸 587
方案10 自製微陣列的雜交 589
第11章 DNA測序 595
導言 596
方案1 毛細管測序質粒亞剋隆的製備 620
方案2 毛細管測序之PCR産物的製備 625
方案3 循環測序反應 627
方案4 全基因組：手工文庫製備 630
方案5 全基因組：自動化的無索引文庫製備 636
附加方案 自動化的文庫製備 642
方案6 全基因組：自動化的帶索引文庫製備 644
方案7 用於Illumina測序的3kb末端配對文庫的製備 651
方案8 用於Illumina測序的8kb末端配對文庫的製備 659
附加方案 AMPure磁珠校準 671
方案9 RNA—Seq:RNA反轉錄為cDNA及其擴增 673
附加方案 RNACleanⅪ’磁珠純化/RNA—Seq前） 679
方案10 液相外顯子組捕獲 680
附加方案 AMPure XP磁珠純化 688
附加方案 瓊脂糖凝膠大小篩選 689
方案11 自動化大小篩選 690
方案12 用SYBR Green-qPCR進行文庫定量 693
方案13 用PicoGreen熒光法進行文庫DNA定量 696
方案14 文庫定量：用Qubit係統對雙鏈或單鏈DNA進行熒光定量 700
方案15 為454測序製備小片段文庫 702
方案16 單鏈DNA文庫的捕獲及emPCR 708
方案17 Rochei454測序：執行一個測序運行 714
方案18 結果有效性確認 721
方案19 測序數據的履量評估 723
方案20 數據分析 724
信息欄 725
第12章 哺乳動物細胞中DNA甲基化分析 729
導言 730
方案1 DNA亞硫酸氫鹽測序法檢測單個核苷酸的甲基化 735
方案2 甲基化特異性聚閤酶鏈反應法檢測特定基因的DNA甲基化 742
方案3 基於甲基化胞嘧啶免疫沉澱技術的DNA甲基化分析 745
方案4 高通量深度測序法繪製哺乳動物細胞DNA甲基化圖譜 749
方案5 亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫的Roche454剋隆測序 760
方案6 亞硫酸氫鹽轉化的DNA文庫的Illumina測序 765
信息欄 770
第13章 標記的DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針的製備 775
導言 776
方案1 隨機引物法：用隨機寡核苷酸延伸法標記純化的DNA片段 792
方案2 隨機引物法：在融化瓊脂糖存在下用隨機寡核苷酸延伸法標記DNA 798
方案3 用切口平移法標記DNA探針 800
方案4 用聚閤酶鏈反應標記DNA探針 804
附加方案 不對稱探針 808
方案5 體外轉錄閤成單鏈RNA探針 809
附加方案 用PCR法將噬菌體編碼的RNA聚閤酶啓動子加至DNA片段上 816
方案6 用隨機寡核苷酸引物法從mRNA閤成cDNA探針 818
方案7 用隨機寡核苷酸延伸法製備放射性標記的消減cDNA探針 820
方案8 用大腸杆菌DNA聚閤酶I的Klenow片段標記雙鏈DNA的3' 端 825
方案9 用堿性磷酸酶進行DNA片段的去磷酸化 831
方案10 含5'突齣羥基端的DNA分子磷酸化 833
方案11 去磷酸化的平端或5'凹端DNA分子的磷酸化 836
方案12 用T4多核苷酸激酶進行寡核苷酸5'端的磷酸化 839
方案13 用末端脫氧核苷酸轉移酶標記寡核苷酸3'端 841
替代方案 用TdT閤成非放射性標記的探針 843
附加方案 加尾反應 843
附加方案 閤成非放射性標記探針的修飾 844
方案14 用大腸杆菌DNA聚閤酶I的Klenow片段標記閤成的寡核苷酸 845
方案15 用乙醇沉澱法純化標記的寡核苷酸 849
方案16 用空間排阻層析法純化標記的寡核苷酸 850
方案17 用Sep-PakCl8柱色譜法純化標記的寡核苷酸 852
方案18 寡核苷酸探針在水溶液中雜交： 在含季銨鹽緩衝液中洗滌 854
信息欄 857
第14章 體外誘變方法 871
尋言 872
方案1 用易錯DNA聚閤酶進行隨機誘變 879
方案2 重疊延伸PCR産生插入或缺失誘變 890
方案3 以雙鏈DNA為模闆的體外誘變：用DpnI選擇突變體 897
方案4 突變型B一內酰胺酶選擇法定點誘變 904
方案5 通過單一限製性位點消除進行寡核苷酸指導的誘變/USE誘變） 910
方案6 利用密碼子盒插入進行飽和誘變 915
方案7 隨機掃描誘變 922
方案8 多位點定嚮誘變 926
方案9 基於PCR的大引物誘變 930
信息欄 933
第15章 嚮培養的哺乳動物細胞中導入基因 937
導言 938
方案1 陽離子脂質試劑介導的DNA轉染 942
替代方案 采用DOTMA和DOGS進行轉染 948
附加方案 單層細胞組織化學染色檢測B一半乳糖苷酶 950
方案2 磷酸鈣介導的質粒DNA轉染真核細胞 952
替代方案 磷酸鈣介導的質粒DNA高效轉染真核細胞 956
方案3 磷酸鈣介導的高分子質量基因組DNA轉染細胞 959
替代方案 磷酸鈣介導的貼壁細胞的轉染 962
替代方案 磷酸鈣介導的懸浮生長細胞的轉染 963
方案4 DEAE-葡聚糖介導的轉染：高效率的轉染方法 964
替代方案 DEAE-葡聚糖介導的轉染：提高細胞活力的方案 966
方案5 電穿孑L轉染DNA 968
方案6 通過alamarBlue法分析細胞活力 972
方案7 通過乳酸脫氫酶法分析細胞活力 974
方案8 通過MTT法分析細胞活力 977
信息欄 980
第16章 嚮哺乳動物細胞中導入基因：病毒載體 998
導言 999
方案1 直接剋隆法構建重組腺病毒基因組 1 019
方案2 將剋隆的重組腺病毒基因組釋放用於挽救和擴增 1023
方案3 氯化銫梯度沉降法純化重組腺病毒 1028
方案4 限製性內切核酸酶消化法鑒定純化後的重組腺病毒基因組 1031
方案5 TCID50終點稀釋結閤qPCR測定重組腺病毒感染滴度 1034
附加方案 準備qPCR的DNA標準品 1042
方案6 濃縮傳代和Real-Time qPCR法檢測有復製能力腺病毒(RCA) 1043
方案7 瞬時轉染法製備rAAV 1051
方案8 氯化銫梯度沉降法純化rAAV 1054
方案9 碘剋沙醇梯度離心法純化rAAV 1059
方案10 肝素親和層析法純化rAAV2 1062
方案11 陰離子交換柱層析法從碘剋沙醇梯度離心後的rAAV樣本中富集完全包裝病毒 1065
方案12 實時定量PCR法測定rAAV基因組拷貝數 1068
方案13 TCID50終點稀釋結閤qPCR法靈敏測定rAAV惑染滴度 1071
方案14 負染色法和高分辨電子顯微鏡分析rAAV樣本形態 1074
方案15 銀染SDS-PAGE分析rAAV純度 1076
方案16 高滴度反轉錄病毒和慢病毒載體的製備 1079
方案17 慢病毒載體的滴定 1085
方案18 監測慢病毒載體儲備液中的可復製型病毒 1089
信息欄 1091
下冊
第17章 利用報道基因係統分析基因錶達調控 1102
導言 1103
方案1 哺乳動物細胞提取物中B一半乳糖苷酶的測定 1112
附加方案 化學發光實驗檢測B一半乳糖苷酶活性 1115
方案2 單螢光素酶報道基因實驗 1118
方案3 雙螢光素酶報道基因實驗 1123
方案4 酶聯免疫吸附試驗定量檢測綠色熒光蛋白 1128
方案5 用四環素調控基因錶達建立細胞係 1131
附加方案 有限稀釋法篩選懸浮細胞的穩定剋隆 1138
信息欄 1140
第18章 RNA乾擾與小RNA分析 1170
導言 1171
方案1 雙鏈siRNA製備 1185
方案2 通過轉染雙鏈siRNA在哺乳動物細胞中進行RNA乾擾 1187
方案3 通過轉染雙鏈siRNA在果蠅S2細胞中進行RNA乾擾 1190
方案4 體外轉錄法製備dsRNA 1192
方案5 采用dsRNA浸泡果蠅S2細胞進行RNA乾擾 1196
方案6 采用dsRNA轉染在果蠅S2細胞中進行RNA乾擾 1198
方案7 小RNA的Northern雜交分析 1199
方案8 反轉錄定量PCR分析小RNA 1203
方案9 構建小RNA高通量測序文庫 1206
方案10 抑製miRNA功能的反義寡核苷酸製備 1215
方案11 在哺乳動物細胞中通過反義寡核苷酸抑製miRNA功能 1216
方案12 在果蠅S2細胞中通過反義寡核苷酸抑製miRNA功能 1218
信息欄 1219
第19章 剋隆基因的錶達以及目的蛋白的純化和分析 1225
導言 1226
方案1 在大腸杆菌中利用可用IPTG誘導的啓動子錶達剋隆化基因 1249
附加方案 目標蛋白可溶性錶達的小量試驗 1255
替代方案 在大腸杆菌中利用阿拉伯糖BAD啓動子錶達剋隆基因 1260
替代方案 信號肽融閤雖白的亞細胞定位 1261
方案2 用杆狀病毒錶達係統錶達剋隆基因 1265
附加方案 噬菌斑測定法確定杆狀病毒原液的滴度 1271
替代方案 用於轉染昆蟲細胞的杆粒DNA製備 1274
方案3用 甲醇誘導啓動子AOX1在畢赤酵母中錶達剋隆基因 1277
附加方案 酵母培養物的凍存 1287
方案4 用於純化大腸杆菌中錶達可溶性蛋白的細胞提取物的製備 1291
附加方案 酵母細胞玻璃珠裂解法 1296
替代方案 溫和的熱誘導的酶裂解法製備大腸杆菌細胞提取物 1298
替代方案 用溶菌酶裂解和凍融法聯用製備大腸杆菌細胞提取物 1300
方案5 采用固化的金屬親和層析純化多聚組氨酸標記的蛋白質 1302
附加方案 Niz+-NTA樹脂的清洗與再生 1309
替代方案 組氨酸標簽蛋白的快速液相色譜純化 1310
方案6 采用榖胱甘肽樹脂以親和層析純化融閤蛋白 1314
方案7 包含體中錶達蛋白的增溶 1321
方案8 蛋白質的SDS-PAGE 1325
替代方案 用考馬斯亮藍進行SDS-PAGE凝膠染色的各種不同方法 1335
替代方案 用銀鹽進行SDS-PAGE凝膠染色 1336
方案9 蛋白質的免疫印跡分析 1340
方案 10測定蛋白質濃度的方法 1347
信息欄 1353
第20章 利用交聯技術分析染色質結構與功能 1358
導言 1359
方案1 甲醛交聯 1369
方案2 製備用於染色質免疫沉澱的交聯染色質 1371
方案3 染色質免疫沉澱(ChIP) 1373
方案4 染色質免疫沉澱-定量聚閤酶鏈反應( ChIP-qPCR) 1377
方案5 染色質免疫沉澱-芯片雜交（ChIP-chip） 1378
方案6 染色質免疫沉澱-高通量測序(ChIP-seq) 1385
方案7 交聯細胞3C文庫的製備 1389
方案8 環形染色質免疫沉澱（ChIP-loop）文庫的製備 1393
方案9 連接産物對照組文庫的製備 1398
方案10 PCR檢測3C、ChIP-loop和對照文庫中的3C連接産物：文庫滴定與相互作用頻率分析 1400
方案11 3C、ChIP-loop和對照組文庫的4C分析 1404
方案12 3C、ChIP-loop和對照組文庫的5C分析 1408
信息欄 1412
第21章 紫外交聯免疫沉澱(CLIP)技術進行體內RNA結閤位點作圖 1415
導言 1416
方案1 CLIP實驗免疫沉澱嚴謹性的優化 1424
方案2 活細胞的紫外交聯和裂解物製備 1429
方案3 RNA酶滴定、免疫沉澱及SDS-PAGE 1432
方案4 3'-接頭的連接祁用SDS-PAGE進行大小選擇 1441
替代方案 去磷酸化RL3接頭5端的標記 1445
方案5 RNA標簽的分離、5二接頭的連接和反轉錄PCR擴增 1446
方案6 RNA CLIP標簽測序 1456
方案7 RNA接頭膠迴收及保存 1458
信息欄 1460
第22章 Gateway相容酵母單雜交和雙雜交係統 1464
導言 1465
方案1 構建酵母單雜交DNA-誘餌菌株 1474
替代方案 用復性引物從DNA誘餌中獲得入門剋隆産物 1481
方案2 生成酵母雙雜交DB-誘餌菌株 1484
方案3 從活化域捕獲文庫中鑒定相互作用分子 1490
方案4 高效的酵母轉化 1496
方案5 用於B-半乳糖苷酶活力的菌落轉移比色測定 1500
方案6 酵母剋隆的PCR 1502
信息欄 1504
附錄1 試劑和緩衝液 1507
附錄2 常用技術 1533
附錄3 檢測係統 1541
附錄4 一般安全原則和危險材料 1565
索引 1573


在綫試讀
第1章 DNA的分離及定量
導言|DNA分離 2
純化DNA的商業試劑盒 3
DNA定量 5
方案|1 SDS堿裂解法製備質粒DNA：少量製備 9
2 SDS堿裂解法製備質粒DNA：大量製備 12
3 從革蘭氏陰性菌（如Ecoli）中分離DNA 15
4 乙醇法沉澱DNA 17
5 異丙醇法沉澱DNA 21
6 用微量濃縮機進行核酸的濃縮和脫鹽 22
7 丁醇抽提法濃縮核酸 23
8 聚乙二醇沉澱法製備M13噬菌體單鏈DNA24
9 M13噬菌體鋪平闆 27
10 M13噬菌體液體培養 30
11 M13噬菌體雙鏈（復製型）DNA的製備 32
12 利用有機溶劑分離純化高分子質量DNA 35
13用蛋白酶K和苯酚從哺乳動物細胞中分離高分子質量DNA 37
14一步法同時提取細胞或組織中的DNA、RNA和蛋白質 43
15從鼠尾或其他小樣本中製備基因組DNA 46
替代方案不使用有機溶劑從鼠尾分離DNA 48
替代方案一管法從鼠尾中分離DNA 49
16快速分離酵母DNA 50
17微型凝膠電泳後使用溴化乙錠( EB)估算條帶中DNA數量 52
18利用Hoechst33258通過熒光分析儀估算DNA濃度 53
19用PicoGreen定量溶液中的DNA 55
信息欄| 從石蠟包埋的甲醛固定組織中提取DNA 56
聚乙二醇 57
a-互補 58
X-Gal 59
盡量降低對高分子質量DNA的損傷 59
貪光光度法 60
導言
雙鏈DNA是非常惰性的化學物質。它潛在的反應基團隱藏在中央螺鏇部位，並經氫鍵緊密連接。堿基對外側受磷酸鍵和戊糖形成的強大環層的保護，這種保護因內在的堿基堆積力而進一步加強。如此堅固的結構和保護，使得DNA在現代犯罪現場和古代墓葬等完全不同的場所中比大多數細胞內其他成分保存時間更長。這樣的化學耐久性賦予基因組DNA文庫的持久性和價值，使得或大或小的遺傳工程和測序計劃成為可能。
盡管雙鏈DNA在化學上是穩定的，但它在物理結構上是易碎的。高分子質量的DNA長而彎麯、側麵不穩定，因此更容易受到*柔和的流體剪切力的傷害。雙鏈DNA在溶液中隨機捲麯，並由於堿基對之間的堆積作用和DNA骨架上磷酸基團間的靜電排斥力而變得黏稠。因為移液、振蕩或攪拌引起的液流，在黏滯的盤繞物上産生的拖拉力，可以切斷雙鏈DNA。DNA分子越長，破壞其所需的力越小。因此基因組DNA很容易變成片段形式，並且隨著分子質量增加，分離的難度也相應增加。大於l50kb的DNA分子在常規分離基因組DNA過程中易於斷裂。
DNA分離
DNA的分離是DNA純化、成功剋隆的關鍵步驟。DNA製備得越純，DNA作為模闆或者底物的酶反應效率會趲高。在20世紀30-40年代，科技文獻中開始積纍瞭一些從細胞中提取DNA並去除能夠抑製或者競爭酶催化反應的細胞成分的方法。自此，成韆上萬種從不同器官、組織和體液中純化DNA的方法被發錶。一般來說，這些過程通過3個步驟便可快速成功。
1．裂解宿主細胞，通常使用這些成分：
·離子去汙劑，如SDS
·離液劑（如胍鹽）
·與離子去汙劑結閤的堿
2．從細胞中釋放DNA，去除與DNA結閤的蛋白質並快速使胞內核酸酶失活，如：
·酶水解蛋白和RNA
·從層析液中吸收、釋放DNA（例如，玻璃粉末或者陰離子樹脂；多種商品化DNA純化試劑盒是基於 該技術進行開發的）
·利用有機溶劑（苯酚和／或氯仿）抽提裂解液以去除DNA溶液中的蛋白質
3．利用乙醇或者異丙醇沉澱DNA去除鹽離子
由於質粒被廣泛應用，因此分離質粒DNA十分重要。人們使用堿與SDS裂解法從大腸杆菌中分離製備質粒DNA已有30多年的曆史(Bimboim and Dolv 1979)。菌液在高pH條件下加入強離子去汙劑能夠破壞細胞壁，使蛋白質與染色體DNA變性，並將質粒DNA釋放到上清液中。
溶菌過程中，菌體蛋白、破碎的細胞壁和變性的染色體DNA交織成一個大的復閤物，被十二烷墓硫酸鹽包裹。這些復閤物能夠通過將鈉離子替換成鉀離子而被有效沉澱下來(Ish-Horowicz and Burke 1981)。離心去除變性劑後，就可以從上清液中迴收復性的質粒。
在SDS的存在下，堿裂解法是一種非常靈活、有效的方法，它對Ecolz的所有菌株都適用，並且其細菌培養物的體積可以從ImL到500mL以上。但是，實驗中的關鍵是要動作快，因為長時間暴露在變性的條件下會對閉環DNA造成不可逆變性(Vinograd andLebowitz 1966)。這種變性的摺疊捲麯DNA不能被限製酶切割，它的瓊脂糖電泳速率是綫性、超螺鏇和環狀等天然結構DNA電泳速率的兩倍，並且不易被嵌入染料染色。堿裂法在製備質粒過程中常會産生不同數量摺疊形式的DNA。
這種方法適用於大小在l5kb以下的質粒。大於l5kb的質粒容易在細胞裂解和隨後的處理中斷裂。利用等滲蔗糖溶液裂解細菌，並用溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）去除細胞壁，可解決受損。産生的原生質球可通過加入去汙劑(如SDS)被裂解。瞭解更詳細的方法，請詳見Godson和Vapnek (1973)。
純化DNA的商業試劑盒
商業公司將過去DNA提取與純化的技術應用到試劑盒中，然後齣售。它是預包裝的試劑，具有非常清楚並且簡潔的說明，對操作人員的要求簡單，使操作人員很容易快速上手，並且結果可多次重復。這些試劑盒可用於純化不同來源的DNA及用於不同實驗目的。但現在的文獻中缺少對這些試劑盒進行直接的比較。事實上，製造商現在掌握著這些資源。
如何看待這些試劑盒是具有節省時間的優勢還是具有破壞性影響，在很大程度上取決於你所處的年代和培訓背景。經曆過分子剋隆早期研宄的科學傢，可能會認為試劑盒就像快餐食物一樣：簡單、不用思考、無創造力，是科學的仿製品。可是試劑盒使用起來如此簡便，為什麼要糾結它們的作用原理呢？或許無知是福吧(Grav1742)。
試劑盒給我們帶來瞭很多的好處：它們提供瞭一種高度可靠的、能夠與自動化任務相融閤的技術。因為僅需要很少的專業知識，所以降低瞭新研究者進入分子剋隆領域的門檻，並且加速瞭科學發展的進程。例如，我們可以用試劑盒從檔案組織中分離其DNA從而研究遺傳疾病，還可以研究惡性組織中基因錶達的異常（詳見“從石蠟包埋的甲醛固定組織中提取DNA”）。此外，若沒有試劑盒製備的快速性和重復性，大量的樣本要想滿足自動DNA測序儀的需求，我們還需要幾十年纔能實現人類基因組測序計劃。
試劑盒就存在於我們的身邊，在很多實驗室中甚至是不可缺少的，不管你喜不喜歡它，它都會在日新月異的科學領域發揮越來越重要的作用。
許多試劑盒開始利用DNA選擇性吸附穩定固定相（通常是二氧化矽或者矽酸鹽）的特性進行DNA純化。*初的文章(Vogelstein and Gillespie 1979；Marko et al.1982)描述瞭矽酸鹽粉末（堿石灰玻璃和硼矽酸鹽玻璃）如何快速雙定量結閤DNA。在高pH、高鹽緩衝液中，DNA吸附在二氧化矽介質上，在低鹽濃度下可被洗脫下來。這種結閤不依賴堿基配對或者拓撲學特徵，可被離液劑增強，如能夠破壞核酸周圍水化層的胍基鹽。玻璃錶麵的陽性離子隨後可以在DNA骨架中磷酸負電基團和矽醇負電基團(Si-OH)之間形成鹽橋。結閤力的強度與成橋離子類型有關(Romanowski et al 1991)。一旦被吸附，在溶液中（如5%乙醇）的DNA還可以被吸附在介質上，而與其他的生物多聚物（如RNA和糖）分開。然而，當用水溶液對吸附的DNA進行水化時，DNA可被洗脫下來並（大部分）在洗脫液中被迴收。得率由DNA的大小決定：片段越小，與二氧化矽結閤越緊密，得率越低。洗滌緩衝液，尤其含易揮發液體的（如乙醇），應該現用現配。
做二氧化矽試劑盒的製造商不願意提供他們的樹脂結構及特性的詳細數據。許多試劑盒用二氧化矽來吸附高密度的陰離子基團來建立鹽橋。這些陰離子二氧化矽有著很強的結閤能力，但是批次之間的不同成為早期二氧化矽樹脂被廣泛應用的阻礙，現在問題已經解決瞭。這種結閤不受溶液中的去汙劑(Triton X一100)或結構破壞劑（胍基鹽、碘化鈉或高氯酸鈉>的影響。
陰離子二氧化矽介質可存在多種形式，如凝膠狀、玻璃粉、微粒狀、鏇轉柱、膜狀和多牆平闆狀。二氧化矽材質經常做成平行設計，因為這樣可在芯片製造中將其嵌入卡槽。依據二氧化矽材質的結構，DNA可通過重力進行吸附和洗脫，還可通過泵或離心加速該過程。商品化樹脂的製造商會根據不同的情況來製訂詳細的DNA純化方案。因為DNA的吸附和洗脫依賴特定樹脂的結構和衍生化，製造商一般會提供說明書。
二氧化矽材料直至今日還是高科技産物，所以價格還很昂貴，但它們能夠為實驗室節省很多時間和精力，進而大大提高瞭成本利用率。由於還有5010 -1 00io的DNA依然吸附在介質上，因此二氧化矽柱在用完一次後必須廢棄。然而，我們可以將柱上殘留的DNA洗去，使之再生後重新使用，這樣能夠降低成本(如Esser et al 2005，2006)。如果把勞動力成本考慮進去的話，這種節約是否能夠提高成本效率並不明確。
不是所有的商業試劑盒都用二氧化矽材質去結閤DNA，因為DNA是一個大的多價陰離子物，在低離子強度作用的緩衝液中能夠與任何陽離子結閤，在高離子強度的緩衝液中被洗脫。強電荷基質能夠緊密結閤DNA，但是DNA的復性非常慢，尤其是在離心柱上。一些商業化試劑盒用陽離子柱效果也很好，可有效獲得高純度DNA（如Applied Biosystems公司的PrepMan誡劑盒）。
選擇哪一種試劑盒呢？目前有很多DNA製備試劑盒已經進入市場。就算實驗經驗匱乏的人也能夠使用這些試劑盒從任何你想到的來源中提取和純化DNA。
生産DNA純化試劑和試劑盒的公司有Applied Biosystems公司、Brinkmann公司、Clontech公司、Millipore公司、Agilent公司、Life Technologies公司、Promega公司及市場領導者QIAGEN公司。目前並沒有對這些公司試劑盒提取DNA的成本、效率、速度及可重復性進行比較。但這個市場競爭十分激烈，劣質産品不會存在太久。我們建議根據自己的目的來比較這些公司産品（産量、速度、花費等），然後選擇一個性價*高的産品。現在湧現瞭很多公司推銷可同時純化多種樣本DNA的工作站和自動化儀器。目前，這些儀器的主要使用者是基因組測序工廠、基因檢測實驗室和分子病理實驗室的人。很快它們會像PCR -樣普遍。
高分子質量DNA的分離
試劑盒純化的基因組DNA在大小上(一般為50-lOOkb)可作為Southern雜交和PCR的模闆。因此，當DNA用於特定用途如構建基因組文庫（剋隆的DNA大小尤為重要）時，商品化的試劑盒用處幣大。為使剪切力降到*低，200kb大小的DNA可用去汙劑裂解細胞，強蛋白酶(如鏈黴蛋白酶和蛋白酶K)處理裂解液，並利用有機溶劑進行多次萃取（一般為水飽和的酚一氯仿溶液）。*後的水相經過廣泛透析以去除低分子質量的汙染及調整離子濃縮。如果可能，盡量避免用乙醇沉澱DNA。
此方法的雛形可追溯到60年以前。如果操作足夠謹慎和耐心，有機溶劑萃取可産生足夠大分子質量的基因組DNA，以用於在某些高容量載體中構建真核基因組DNA文庫。
盡管此方法值得尊敬，但與其他實驗室常規方法相比，仍是對技術與耐心的巨大挑戰，並且也有一些缺點。例如，該過程需使用有毒試劑，並且涉及多次水相與有機相的費力分離；長DNA很容易斷裂，非常容易被切割成小的片段。成功的關鍵在於通過使用寬口徑的移液器，避免振蕩、渦鏇和乙醇沉澱，以及避免色譜樹脂降低剪切力。高分子質量的DNA分離方法無法自動化，並且不適閤多個樣本的平行操作。
在以下情況下需要更加謹慎以降低剪切力對DNA的影響：利用高容量載體如YAC（酵母人工染色體）或BAC（細菌人工染色體）構建基因組文庫時；或DNA樣品從常染色體通過脈衝電泳進行分離時。為避免DNA被打斷，瓊脂中固定的憲整細胞用酶處理以破壞其細胞壁並去除細胞蛋白。釋放的DNA可在瓊脂槽中被固定，並在原位被限製酶水解，這與DNA在溶液中是相同的(瞭解更詳細的分離及分析超高分子質量DNA的方法，詳見Birren and Lai 1993)。
DNA定量
確定DNA的數量對於分子剋隆中獲得可重復、精確及有效的結果是十分必要的。常規使用3種方法進行DNA定量：紫外分光光度法、熒光分析法和絕對定量法。
紫外分光光度法
紫外分光光度法是利用分光光度計來測定DNA溶液的吸收值（見信息欄“分光光度法”）。在水相中，雙鏈DNA在260nm附近具有*大吸光度，吸光係數約為50。實際上，雙鏈DNA的紫外光譜範圍從約4ytgimL到約50ytgimL。然而，分光光度計法定量對多種乾擾成分十分敏感，這些成分可以是單鏈DNA、RNA、蛋白質、核苷酸、含有苯環的芳香族化閤物及溶液中的顆粒等。
通過測定單波長( 260nm)下的吸光度來定量核酸濃度實際效果並不好。樣品的吸光度可以在多個波長下（230nm、260nm、280nm與320nm）進行測定，因為在這些波長下的吸光度可指示樣品製備的純度。
·230nm。胍鹽、苯氧基離子、硫氰酸酯及其他經常用於核酸製備的化閤物在該波長下具有強吸收。
·280nm。芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸在該波長下具有強吸收。多年以來，260nm與280nm的吸光 度比值一直用於檢測核酸中是否汙染瞭蛋白質。這頊測定盡管十分普遍，但卻值得懷疑。這個方 法需追溯到Warburg和Christian (1942)的研究，他們發現OD260iOD280比值是核酸中是否汙染蛋 白質的很好的指示。但事實上這並不是真的！DNA在260nm的吸收很強，隻有在被大量蛋白質汙染 的條件下纔會引起兩個波長下吸光度比值的顯著變化。
·320nm。在高波長下的吸收一般是由光散射造成的，可用於指示核酸製備過程中特定物質引起的 濁度。
根據實驗經驗，OD260iOD280比值在17-20，並且在230nm和320nm處吸收度較小的DNA製備物，被認為是純度足夠高，可以作為分子剋隆各個過程中的模闆和底物。
測定DNA溶液的吸光度可以使用傳統的分光光度計或針對生物大分子設計的儀器（如Eppendorf公司Biophotometer）。詳細信息見信息欄“分光光度法”。
紫外光譜使用的是石英杯，各種形狀及大小均可，包括多數實驗室測定DNA濃度常用的微量杯或超微量杯。當使用超微量石英杯時，應確保其窗口高度與特定分光光度儀的射束高度相匹配。如果窗口高度錯誤，光束要麼完全不能穿過樣品，要麼需要更大體積的樣品纔能得到結果。
NanoDrop Technologies鐺售的分光光度儀可用於測定微量體積DNA、RNA和蛋白質的吸光度。這種分光光度儀利用光束下錶麵張力僅需要微量液滴(l-2ytL)，進而避免需要石英杯及其他樣本容器。此外，NanoDrop分光光度儀不需要稀釋即可測定高濃度的DNA溶液（比標準的石英杯分光光度儀所能測量的濃度要高50倍）。
接觸樣品的錶麵非常容易並快速地被清洗，因此可在短時間內測定多個樣品。為避免問題産生，可進行下列操作。
·確保DNA溶液在測定前充分混勻。因為樣品體積很小(2ytL)，沒有混勻會使取得的樣品不具有代 錶性。
·少量體積樣品加入到分光光度儀的底座後，會很快揮發，並導緻測齣的DNA濃度比實際的要高。 為減少這個問題的影響，可將NanoDrop分光光度儀放在溫度可控、通風的環境下，並保持樣品放 置於蓋瞭蓋子的管中。操作要快。應該在樣品加到分光光度儀底座後盡快讀數。
熒光分析法
熒光分析法用特定結閤DNA的染料來測定雙鏈DNA的濃度。常用的DNA染料包括溴化乙錠、Hoechst33258、SYBR Green I和II、SYBR Gold及PicoGreen。
溴化乙錠
溴化乙錠含有三環菲啶平麵環係統，可嵌入到雙鏈DNA堿基之間。嵌入DNA雙螺鏇後，溴化乙錠的菲啶環平麵位於與螺鏇軸相垂直的位置，並通過範德瓦耳斯力與上下堿基結閤。而其平麵環係統被埋在底部，其外側的苯基和乙烷基處於DNA雙螺鏇的大溝內。在高強度離子溶液的飽和狀態，大約每2 5個堿基對嵌入一分子的溴化乙錠，這與DNA的堿基組成無關。溴化乙錠的嵌入一般不會對堿基對的構象及其在螺鏇中的位置産生影響，除瞭會使堿基對沿螺鏇軸移位34A (Waring 1965)。這種移位可造成飽和溴化乙錠的DNA分子長度增加27010 (Freifelder 1971)。
溴化乙錠還可以高度可變計量學與RNA和熱變性或單鏈DNA形成的鏈間堿基對結閤LWaring 1965，1966; Lepecq and Paoletti 1967)。溴化乙錠平麵基團的固定位置及其與堿基的密切接近可使結捨的染料散發的熒光比遊離在溶液中的染料要強20-25倍。254nm的紫外綫(UV)照射由DNA吸收，並轉移至溴化乙錠；302nm和366nm的紫外綫照射由溴化乙錠本身吸收。在590nm和可見光的紅一黃區一小部分（約0 3）可被重新釋放齣來LLepecqand Paoletti 1967; Tuma et al 1999).
大多數銷售的UV光源可發射302nm的UV光。溴化乙錠-DNA復閤物在此波長産生的熒光明顯強於366nm，但略微低於較短的波長(254nm)。然而，DNA分子的光漂白和斷裂作用在302nm要比在254nm處低得多(Brunk and Simpson 1977)。
溴化乙錠主要用於檢測瓊脂糖中的DNA（Aaij and Borst 1972; Sharp et al 1973），但這種染料也還可以用於半定量地估算DNA溶液的濃度(見方案17)。
▲在酵母及沙門氏菌中，溴化乙錠本身並不容易誘發突變，但它通過微粒體酶代謝的化颱物可中度誘變( Mchler and Bastos1974：McCann et al 1975; MacGregor and Johnson 1977，Singer et al 1999)。多數研究所開發瞭安全操作廈處理含有溴化乙錠溶液及膠的說明。研究者應該根據這些說明來處理溴化乙錠。安全處理溴化乙錠的試劑盎也可通過Schleicher＆Schuell和Qbiogene公司及其他渠道獲得。
Hoechst 33258
Hoechst 33258是一類雙一苯並眯唑熒光染料，可高特異性非插入地結閤於DNA雙鏈的小溝。結閤的染料産生的熒光從0 01上升到06 (Latt and Wohlleb 1975)，因此，Hoechst33258用於雙鏈DNA溶液的熒光檢測及定量。Hoechst 33258比溴化乙錠更優先使用，因為它具有非常強的區分雙鏈DNA與RNA及單鏈DNA的能力(Loontiens et al 1990)。
與其他非嵌入染料類似（Mllller and Gautier 1975），Hoechst 33258可優先結閤DNA螺鏇中的富含AiT區(Weisblum and Haenssler 1974)，並隨著A+T含量的增加，熒光強度以10的對數增長(Daxhelet et al 1989)。Hoechst 33258與雙鏈DNA結閤産生的熒光比與單鏈DNA結閤要強3倍左右（Hilwig and Gropp 1975）（見方案18）。
SYBR Green l
SYBR Green I(Life Technologies)足一種嵌入型青藍色染料，在488nm藍色光照射激發後，在522nm（綠光）具有發射高峰。盡管SYBR Green I可加入到凝膠上樣緩衝液中，但並不推薦這樣使用，因為該染料對DNA在凝膠中的遷移影響很大。為得到*好的效果，凝膠應該進行預染處理。由於産生的熒光很強，SYBR GreenI是一種可用於檢測少量DNA

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