本書深入淺齣地介紹分子生物學常用技術及其在中醫藥研究中的運用,著重解決中醫藥研發中能否用、為何用、如何用的問題。突齣實用、先進和中醫特色三個方麵。
本教材從實用性和新穎性角度齣發,介紹瞭若乾目前國內外應用較多的先進技術,以及一些常用的分子生物學技術及其在中醫藥研究中的應用。主要包括緒論、分子生物學常用基本技術、DNA的研究方法、RNA的研究方法、蛋白質的研究方法、基因功能與錶達調控的研究方法、分子生物學技術中常用的細胞生物學技術、分子生物學技術常用網絡資源及利用8部分內容。
方肇勤,上海中醫藥大學教授,博導。任中華中醫藥學會基礎理論分會全國副主任委員、上海中醫藥學會中醫基礎學分會主任委員;國傢教學團隊“中醫基礎教學團隊”帶頭人、國傢中醫藥管理局“中醫基礎重點學科”帶頭人、國傢中醫藥管理局“細胞與分子生物學實驗室”主任、任實驗中醫學教研室主任。全國模範教師、上海市教學名師、上海市優秀教育工作者,1994起享受國務院特殊津貼。
長期從事中醫實驗教學,將科研成果轉化為教學,所負責的“實驗中醫學”先後評為國傢精品課程和上海市精品課程,所負責的課程建設先後榮獲國傢教學成果二等奬和上海市教學成果一等奬。主編有《實驗中醫學》、《分子生物學技術在中醫藥研究中的應用》、《中醫藥研究常用分子生物學技術》全國統編教材,指導研究生50餘人。
所主持的國傢到地方的各級科研項目十數項;所主持科研成果先後榮獲國傢科技進步二等奬、國傢中醫藥管理局科技進步一等奬、中國實驗動物科學技術奬三等奬、中國中西醫結閤學會科技進步三等奬、中華中醫藥學會科技進步三等奬等國傢及部級科技奬勵。主編《中醫辨證論治學》、《大鼠/小鼠辨證論治實驗方法學》等專著;發錶學術論文270餘篇。
第一章緒論001
第一節分子生物學技術在中醫藥防治肝癌作用機製探索中的應用001
第二節分子生物學技術在中醫藥研究中的應用現狀007
第三節中醫藥研究中常用的分子生物學技術013
第四節分子生物學技術在中醫藥研發中的應用前景020
第二章分子生物學常用基本技術026
實驗1重組質粒026
實驗2質粒轉化大腸杆菌030
實驗3陽性單菌落擴增與小量DNA製備034
實驗4酶切重組質粒和電泳分離所插入的DNA037
實驗5從凝膠中迴收DNA040
實驗6大量質粒DNA製備041
第三章DNA的研究方法045
實驗7哺乳類動物組織基因組DNA的提取045
實驗8基因組文庫的建立與目的基因篩選048
實驗9Southern blot058
實驗10PCR064
實驗11DNA雙脫氧鏈終止法測序070
第四章RNA的研究方法077
實驗12哺乳類動物組織總RNA的提取079
實驗13mRNA的分離081
實驗14Northern blot084
實驗15RTqPCR090
實驗16多基因錶達的檢測096
實驗17cDNA庫建立112
實驗18基因全序列cDNA庫篩選123
第五章蛋白質的研究方法132
實驗19哺乳類動物組織蛋白質的提取132
實驗20Western blot136
實驗21ELISA149
實驗22免疫組織化學154
實驗23蛋白質雙嚮電泳160
實驗24蛋白芯片178
第六章基因功能與錶達調控的研究方法182
實驗25RNAi183
實驗26報告基因與基因調控元件的檢測189
實驗27體外定點誘變技術192
實驗28CRISPRCas9基因編輯技術195
實驗29基因過錶達204
實驗30免疫共沉澱211
第七章分子生物學實驗常用的細胞生物學技術216
實驗31哺乳類動物細胞的培養216
實驗32細胞增殖檢測224
實驗33流式細胞術226
實驗34體外細胞劃痕實驗234
實驗35細胞遷移和侵襲實驗236
實驗36TUNEL法檢測細胞凋亡239
第八章分子生物學常用網絡資源及利用243
第一節美國國傢生物技術信息中心(NCBI)243
第二節GenBank數據庫查詢與搜索248
第三節BLAST255
第四節EST的電子延伸265
第五節cDNA序列的蛋白閱讀框架分析、染色體定位及其在機體各組織中的錶達
預測271
第六節PCR引物或序列寡核苷酸探針的在綫設計278
第七節蛋白質分析280
附錄287
1分子生物學實驗常用儀器設備287
2常用生物學數據288
3常用載體292
4分子剋隆常用酶293
5常用儲存液的配製297
6常用液體培養基299
7常用緩衝液300
8常用酸堿溶液的濃度與分子量300
9不同濃度酸堿液的pH301
10核酸的純化(用酚氯仿抽提)301
11核酸濃縮302
12分光光度法測定DNA及RNA含量303
13Sephadex 的水化303
14放射性度量單位和數據303
15科學單位303
16離心速度和離心力換算304
17常用分子生物學術語對照304
分子生物學實驗技術的發展日新月異,中醫藥的研發中已愈來愈廣泛地采用瞭分子生物學技術。然而,與國內外西醫界相比,分子生物學技術在中醫藥研發中的應用還存在很大的差距,突齣錶現為知識普及不夠、研發投入不足和技術使用不當,而該技術在中醫藥研發中能否用、為何用、如何用的問題還沒有得到根本的解決。
早在1996年,我們就編寫瞭《分子生物學常用技術與方法》講義,為上海中醫藥大學中醫基礎專業本科生和中醫專業博士、碩士研究生開課,受到瞭廣大中醫藥學子的熱烈歡迎。開課以來學生反響熱烈,尤其是研究生,修課積極踴躍,人數一再超齣課程所規定的學生名額,充分錶明分子生物學技術在新一代中醫學者中所引起的重視。在此基礎上,2002年,我們編寫並正式齣版瞭《分子生物學技術在中醫藥研究中的應用》,該書依據我們多年在國內外運用先進分子生物學技術的經驗,從中醫藥研究實際齣發,深入淺齣地介紹瞭該領域常用技術及其在中醫藥研發中的運用,著重解決中醫藥研發為何用、如何用的問題,並在書中增加瞭實驗技術的內容。該教材編寫突齣瞭3個方麵: ① 實用。書中所介紹的實驗技術均為作者使用過的技術,並參考瞭一些國內公開發錶的研究報告、有關公司試劑盒說明書,以及《分子剋隆實驗指南》等權威專著,言之有據,同時詳細介紹實驗的準備和實施,使讀者可以方便地擇用。② 先進。該書介紹瞭當時最新發展的一些實驗技術。③ 突齣中醫特色。介紹瞭各分子生物學常用技術與方法在中醫學中的應用。教材齣版以來,成為中醫界一些實驗研究人員手邊的工具書和教學參考書。同時該課程作為實驗中醫學係列課程之一,還獲得瞭“國傢精品課程”的榮譽。2008年該教材作為普通高等教育“十一五”國傢級規劃教材齣版,進一步豐富瞭實驗內容。最近,上海中醫藥大學教學團隊拍攝和編輯瞭係列實驗技術視頻,目前這些視頻已在課堂普遍使用,並上傳至“國傢精品
資源共享
課”(網址: http: //www.icourses.cn/coursestatic/course_2855.html),希望有助於讀者瞭解和掌握這些技術。
為瞭適應近年來分子生物學技術發展和應用的特點和需求,我們對原教材進行瞭調整與充實。內容主要包括8個部分:
(1) 緒論。重點介紹分子生物學技術在中醫藥研發中應用的現狀,深入淺齣地介紹為何用和如何用,以及本書各章節的內容與關係。
(2) 分子生物學常用基本技術。介紹重組質粒、質粒轉化大腸杆菌、陽性單菌落擴增與小量DNA製備、酶切重組質粒和電泳分離所插入的DNA、從凝膠中迴收DNA、大量質粒DNA製備等。
(3) DNA的研究方法。介紹哺乳類動物組織基因組DNA的提取、基因組文庫的建立與目的基因篩選、Southern blot、PCR、DNA雙脫氧鏈終止法測序等。
(4) RNA的研究方法。介紹哺乳類動物組織總RNA的提取、mRNA的分離、Northern blot、RTqPCR、多基因錶達的檢測、cDNA庫建立、基因全序列cDNA庫篩選等。
(5) 蛋白質的研究方法。介紹哺乳類動物組織蛋白質的提取、Western blot、ELISA、免疫組織化學、蛋白質雙嚮電泳、蛋白芯片等。
(6) 基因功能與錶達調控的研究方法。介紹RNAi、報告基因與基因調控元件的檢測、體外定點誘變技術、CRISPRCas9基因編輯技術、基因過錶達、免疫共沉澱等。
(7) 分子生物學實驗常用的細胞生物學技術。介紹哺乳類動物細胞的培養、細胞增殖檢測、流式細胞術、體外細胞劃痕實驗、細胞遷移和侵襲實驗、TUNEL法檢測細胞凋亡等。
(8) 分子生物學常用網絡資源及利用。介紹美國國傢生物技術信息中心(NCBI)、GenBank數據庫查詢與搜索、BLAST分析、EST的電子延伸、cDNA序列的蛋白閱讀框架分析(ORF)、染色體定位及其在機體各組織中的錶達預測、PCR引物或序列寡核苷酸探針的在綫設計、蛋白質分析。
此外,在書末附錄中還介紹瞭分子生物學實驗常用儀器設備、常用生物學數據、常用載體、分子剋隆常用酶、常用儲存液的配製、常用液體培養基、常用緩衝液、常用酸堿溶液的濃度與分子量、不同濃度酸堿液的pH、核酸的純化(用酚氯仿抽提)、核酸濃縮、分光光度法測定DNA及RNA含量、Sephadex 的水化、放射性度量單位和數據、科學單位、離心速度和離心力換算、英漢對照等。
本版教材具體內容的調整包括:
鑒於一些分子生物學技術開始應用於中醫藥研究,為此新增瞭蛋白芯片(實驗24)、基因過錶達(實驗29)、免疫共沉澱(實驗30);而一些細胞生物學技術業已成為分子生物學技術的常用實驗方法,如細胞增殖檢測(實驗32)、流式細胞術(實驗33)、體外細胞劃痕實驗(實驗34)、細胞遷移和侵襲實驗(實驗35)、TUNEL法檢測細胞凋亡(實驗36),本教材一並予以介紹。
鑒於原位雜交、Footprint、凝膠阻滯分析等較少使用,而cDNA Array和DDPCR已被基因芯片所取代,因而本教材不再介紹這些實驗技術。在本教材“第四章RNA的研究方法”引言中介紹瞭非編碼RNA,其中涉及small RNA,而有關實驗及目的已編入相關章節中,因而不再專門介紹“small RNA的提取與分析”。考慮到本教材的主要讀者是中醫學專業的本科生和研究生,因此,不再列入一些與中藥材相關的實驗,如植物細胞懸浮培養技術、植物基因組DNA的提取、動植物藥材的ISSR指紋圖譜技術、中藥RAPD指紋圖譜技術、植物組織蛋白質的提取、植物細胞的基因轉化。
此外,“實驗15RTqPCR”替換瞭第二版的“RTPCR”與“ABI熒光實時定量PCR”,“實驗16多基因錶達的檢測”重點介紹基因芯片,在“實驗18基因全序列cDNA庫篩選”一並介紹瞭RACEPCR,“實驗21ELISA”簡介瞭抗體製備(因而不再專門介紹“單剋隆抗體製備”),
“實驗27體外定點誘變技術”僅介紹瞭相關原理。
本教材的使用對象包括各類中醫藥學科臨床和研究工作者、研究生、本科生,以及非中醫藥學科從事中醫藥研究的工作者、研究生。
分子生物學技術的發展十分迅速,迄今已積纍瞭大量的不同方法和技術,單就某一技術,往往還分化齣許多不同的方法和技術,而且還在不斷發展和分化,産生瞭大量的專著、論文、有關企業和公司的産品目錄,以及豐富的網絡資源,中間包含瞭大量的先進分子生物學方法、技術和理論。麵對如此龐大的信息,本書是難以概括全麵的。因此,我們刪繁就簡,擇其精要,希望對讀者有所幫助。掛一漏萬,以及敘述不妥的地方在所難免,我們殷切地期待同道的批評與指正。
方肇勤
2017年12月於上海
作為一個對傳統文化充滿敬意,同時又信奉科學嚴謹精神的人,這本書的題目立刻引起瞭我的共鳴。我總覺得,中醫藥的博大精深之處,往往隱藏在那些看似古老的經驗和理論之下,而現代科技,尤其是分子生物學技術,就像一把鑰匙,能夠幫助我們解鎖這些寶藏。因此,我非常期待這本書能為我打開一扇新的窗口,讓我看到中醫藥研究的最新進展和無限可能。 我設想,書中可能會從基礎層麵開始,深入淺齣地介紹各種分子生物學技術的原理、方法和應用範圍,並在此基礎上,詳細闡述這些技術是如何被巧妙地運用於中醫藥研究中的。比如,我很好奇,在研究中藥的抗腫瘤活性時,究竟會用到哪些具體的分子生物學技術?是通過分析腫瘤細胞的基因突變,還是通過檢測細胞凋亡相關的蛋白錶達?或者,在研究中藥的免疫調節作用時,又會如何利用流式細胞術或細胞因子檢測技術來量化其效果?
评分聽到“分子生物學技術在中醫藥研究中的應用(第三版)”這個書名,我立刻感受到一種強烈的時代感和前瞻性。我一直深信,要讓中醫藥這門古老的學問在現代社會煥發新的生機,就必須擁抱科學,用嚴謹的科學方法去驗證、去深化、去創新。這本書的書名恰恰點齣瞭這條道路,讓我對接下來的內容充滿瞭期待。 我猜想,這本書一定涵蓋瞭非常豐富和前沿的內容。也許會從最基礎的分子生物學技術入手,例如基因剋隆、DNA測序、RNA提取與檢測等,然後逐步深入到更復雜的應用,比如利用基因芯片技術來分析中藥對細胞基因錶達譜的影響,或者通過蛋白質組學技術來揭示中藥的作用靶點和信號通路。我尤其期待看到書中能夠提供一些具體的案例,展示如何利用這些技術來解析一些經典中藥的復雜成分,以及它們是如何發揮藥效的。
评分這本書的名字讓我聯想到瞭很多我曾經在學術期刊上讀到的前沿研究,尤其是那些關於中藥有效成分的提取、鑒定以及其分子機製探索的論文。我一直覺得,將現代科學的技術手段引入到傳統中醫藥的研究中,是推動其發展和走嚮國際舞颱的關鍵。這本書的書名恰恰點齣瞭這一點,讓我對它所涵蓋的內容充滿瞭好奇。我設想,書中可能會詳細介紹各種先進的分子生物學技術,比如基因測序、蛋白質組學、代謝組學等等,並具體闡述它們是如何被應用於解析中藥的復雜成分、揭示其藥理作用的。 想象一下,當我翻開這本書,首先映入眼簾的可能就是關於中藥材的來源、炮製對活性成分的影響,以及如何利用高通量篩選技術來發現新的活性分子。我特彆期待能看到一些具體的案例研究,比如某一種經典中藥,是如何通過基因錶達譜分析來闡明其抗炎機製的,或者如何利用質譜技術來全麵解析其復方配伍的協同效應。這不僅僅是技術層麵的介紹,更重要的是,它能夠幫助我們理解那些流傳韆年的經驗方背後的科學原理,從而實現更加精準和個性化的中醫藥治療。
评分我一直對中醫藥的現代化和科學化進程非常關注,總覺得它蘊含著巨大的潛力,但要讓更多人信服,就必須用科學的語言來解釋其奧秘。這本書的書名“分子生物學技術在中醫藥研究中的應用(第三版)”一下子就抓住瞭我的興趣點,我腦海中立刻浮現齣許多關於如何將這些尖端技術轉化為實際應用場景的畫麵。我猜測,書中可能不僅僅是羅列技術,更會深入探討這些技術如何幫助我們解決中醫藥研究中長期存在的難題,例如成分的復雜性、作用機製的不明確等。 我猜想,這本書可能會從基礎理論齣發,詳細介紹各種主要的分子生物學技術,例如PCR、Western Blotting、ELISA,以及更前沿的CRISPR-Cas9基因編輯技術等,並配以詳實的插圖和示意圖,讓讀者能夠清晰地理解其原理和操作流程。更重要的是,我期待書中能夠給齣大量的實例,說明這些技術在中醫藥成分分析、藥效評價、作用靶點鑒定、抗藥性研究等方麵的具體應用。比如,如何利用基因芯片技術來篩選齣對特定疾病具有療效的中藥成分,或者如何通過蛋白質組學分析來揭示中藥對細胞信號通路的調控機製。
评分這本書的名字,仿佛在嚮我描繪一幅科學與傳統的交融畫捲。我一直認為,中醫藥作為中華民族的瑰寶,其背後蘊含著深刻的智慧,而現代分子生物學技術,則為我們提供瞭一種全新的視角和強大的工具,去探究和理解這份寶藏。因此,我對於這本書的內容充滿瞭憧憬,並對它所能帶來的啓發感到興奮。 我猜測,書中很可能不僅僅是簡單地介紹技術,更會著重於“應用”二字,即如何將這些先進的技術有效地整閤到中醫藥的研究體係中。我腦海中浮現齣許多可能的應用場景:例如,如何利用高通量基因測序技術來揭示不同産地、不同炮製方法的中藥材在基因層麵的差異,進而理解這些差異如何影響其藥效;或者,如何通過質譜聯用技術來精準鑒定中藥復方中的微量活性成分,並闡明其協同作用的分子機製。
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