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內容簡介

生物醫學常用實驗技術涵蓋醫學院校研究生必須掌握的基本實驗技術。生物醫學常用實驗技術按照不同的研究層麵，分為五個部分：核酸技術、蛋白質技術、細胞技術、動物實驗技術以及其他常用實驗技術。內容涉及核酸、蛋白質等生物大分子的分離與檢測，分子剋隆的基本操作，組織細胞培養，動物實驗基本操作以及常用的病理學技術。此外，也詳細介紹瞭同位素標記生物大分子、流式細胞術、激光共聚焦檢測等研究手段。

目錄

第一章 核酸技術 1
實驗一 質粒DNA的提取和純化 1
實驗二 DNA限製性內切酶酶切及迴收 4
實驗三 DNA轉化及重組子的篩選和鑒定 6
實驗四 RNA抽提與RT�睵CR 8
第二章 蛋白質技術 11
實驗五 酶聯免疫吸附試驗 11
實驗六 蛋白質定量分析 15
實驗七 蛋白免疫印跡技術 18
實驗八 組織切片技術與特殊染色 22
實驗九 免疫組織化學技術 31
第三章 細胞技術 37
實驗十 動物細胞的原代培養和傳代培養 37
實驗十一 MTT法評估細胞增殖活力 41
實驗十二 細胞凋亡檢測 43
第四章 動物實驗技術 48
實驗十三 動物實驗基本技術（1） 48
實驗十四 動物實驗基本技術（2） 51
第五章 其他常用實驗技術 55
實驗十五 共聚焦激光掃描顯微鏡技術 55
實驗十六 生物大分子的放射性核素標記技術 59
實驗十七 流式檢測技術 61
參考文獻 72
彩圖

精彩書摘

第一章核 酸 技 術生物醫學常用實驗技術·1·第一章核 酸 技 術實驗一質粒DNA的提取和純化質粒(plAsmid)是獨立存在於細菌染色體外、能自主復製並能穩定遺傳的一種環狀雙鏈DNA分子，質粒大小為1～200kb，在細菌細胞內它們利用宿主細胞的復製體係閤成質粒自身的DNA。質粒DNA是基因工程常用的基本工具。
【實驗目的】
(1) 掌握質粒DNA的製備原理和方法。
(2) 掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理和實驗方法。
【實驗原理】
1�敝柿�DNA的製備與堿裂解法原理
(1) 質粒DNA的製備：包括3個步驟：1培養細菌，使質粒DNA大量擴增；2收集和裂解細菌；3分離和純化質粒DNA。
(2) 質粒DNA的製備方法：主要包括：1堿裂解法：使用0��2mol NAOH與1%SDS；2煮沸裂解法：沸水煮沸40s；3SDS裂解法：10%SDS，一般用於質粒大量提取。在實際操作中可以根據宿主菌株類型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒DNA的用途進行選擇。本實驗以堿裂解法為例提取質粒DNA。
(3) 堿裂解法的基本原理：質粒DNA 具有特定的形態結構，在特殊的環境條件下，如加熱、極端pH、有機溶劑、尿素、酰胺試劑等會導緻質粒DNA變性，去除變性條件又可以使DNA復性。堿裂解法根據共價閉閤環狀質粒DNA和綫性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離質粒DNA。首先，十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfAte，SDS）是一種陰離子錶麵活性劑，它既能裂解細菌細胞，又能使細菌蛋白質變性。SDS處理細菌細胞後會導緻細菌細胞壁破裂，從而使質粒DNA及細菌基因組DNA從細胞中同時釋放齣來。細菌環狀基因組DNA在操作過程中會斷裂成綫狀DNA分子，當pH介於12��0～12��5這個狹窄的範圍內，綫性的DNA雙螺鏇結構解開而變性。盡管在這樣的條件下，共價閉環質粒DNA的氫鍵會斷裂，但兩條互補鏈彼此相互盤繞結閤在一起。當加入pH4��8乙酸鉀緩衝液時，pH恢復至中性，因為共價閉閤環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而準確；而綫性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速而準確，它們相互纏繞形成不溶性網狀結構。復性的質粒DNA恢復原來構型，保持可溶性狀態，通過離心就可去除染色體DNA和蛋白質�睸DS復閤物等物質，最後用酚氯仿抽提純化上清液中的質粒DNA，乙醇或異丙醇沉澱就可得到純的質粒DNA，之後還可再用超速離心、電泳、離子交換柱層析等方法進一步純化質粒。
2�鼻碇�糖凝膠電泳技術（AgArose gel electrophoresis）是分離、鑒定和提純DNA片段的有效方法。瓊脂糖凝膠可分辨0��1～6��0kb的雙鏈DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子帶負電荷，在電場中嚮正極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應，遷移速度與相對分子質量的對數值成反比關係。不同大小、不同形狀和不同構象的DNA分子在相同的電泳條件下，有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。上樣緩衝液中含有0��25%溴酚藍作為電泳指示劑。電泳時溴酚藍泳動速度快於核酸，當溴酚藍到達凝膠底部3/4位置時，即可停止電泳，進行結果觀察。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙啶（EB）結閤，在紫外燈下可看到熒光條帶，藉此可分析實驗結果。
【實驗材料】
pUC19質粒(具有氨苄西林抗性，Ampr)轉化菌，LB培養基，氨苄西林，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNAse A母液（10mg/ml），TE緩衝液(pH 8��0)，Tris飽和酚，酚/氯仿/異戊醇混閤液（25∶24∶1)，預冷無水乙醇，TAE電泳緩衝液（10×），上樣緩衝液（6×），瓊脂糖，10mg/ml溴化乙啶(EB)，3mol/L 乙酸鉀(pH 4��8)。
【實驗儀器】
恒溫振蕩培養箱，高速冷凍離心機，鏇渦振蕩器，水浴鍋，1��5ml離心管，50ml離心管，不同型號的吸頭，微量移液器，微波爐，電泳儀，製膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，電子天平，手套，紫外透視儀，微量離心管等(圖1��1)。
圖1��1核酸電泳裝置
A�鋇繚矗籅�鋇纈靜奐爸平耗＞�
【實驗方法】
1�敝柿�DNA的提取與純化
(1) 接種pUC19質粒轉化菌於LB液體培養基中，37℃培養過夜。
(2) 取細菌懸液1ml於1��5ml EP管中，4000r/min，離心2min。
(3) 棄上清液，加入100μl溶液Ⅰ。
(4) 加入200μl溶液Ⅱ，顛倒混勻，靜置2min。
(5) 加入150μl溶液Ⅲ，顛倒混勻，靜置5min。
(6) 4℃，12 000r/min，離心10min。
(7) 取400μl上清移入另一EP管，加等體積Tris飽和酚，顛倒混勻，12 000r/min，離心10min。
(8) 取約350μl上層水相移入另一EP管，加等體積酚/氯仿/異戊醇，顛倒混勻，12 000r/min，離心10min。
(9) 取300μl上層水相移入另一EP管，加2倍體積無水乙醇，-20℃放置1��5h，沉澱DNA。
(10) 12 000r/min，離心10min，棄上清，加入1ml 70%乙醇洗滌DNA沉澱，小心吸棄乙醇。
(11) 室溫5min乾燥DNA，加入20μl TE緩衝液（含20μg RNAse A）溶解DNA，37℃水浴鍋放置30min以降解RNA。
(12) 取5μl質粒DNA，與1μl 6×上樣緩衝液混勻，1%瓊脂糖凝膠電泳。
(13) 穩壓110V，電泳40min，紫外燈下觀察結果並拍照。
2�鼻碇�糖凝膠製備
(1) 將凝膠成形模具水平放置，將選好的梳子放好，梳子底部與模具之間留1mm空間。
(2) 稱取DNA電泳用瓊脂糖1g放入250ml的三角燒杯中，加入100ml 1×TBE緩衝液，混勻後，將燒瓶置於微波爐中，加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解，配製成濃度為1%的膠。
(3) 取齣三角燒瓶，將其置室溫下冷卻至70℃左右（手握燒瓶可以耐受），再加入溴化乙啶（10mg/ml）5μl，混勻後，即將凝膠溶液倒入膠闆鋪闆。本實驗所用製膠闆約需膠液30ml。
(4) 室溫下待凝膠完全凝固，拔齣梳齒，將膠闆放入電泳槽中。
(5) 在電泳槽中加入1×TBE緩衝液，以高齣凝膠錶麵2mm為宜，即可開始點樣、電泳。
圖1��2質粒DNA電泳圖
【結果分析】
質粒DNA在含有溴化乙啶的瓊脂糖凝膠電泳中，被染成橘紅色。質粒DNA可以觀察到3條帶，電泳速度最慢的條帶顯色最淺(圖1��2)。質粒DNA有3種構型，即共價閉閤環狀質粒(cccDNA)、開環質粒 (OCDNA)和綫狀質粒DNA (LDNA)。在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳後呈3條帶，超螺鏇質粒DNA泳動最快，其次為綫狀DNA，最慢的為開環質粒DNA。
【注意事項】
在加入細菌裂解液後，細菌基因組DNA與質粒DNA分離，細菌環狀基因組DNA在操作過程中會斷裂成綫狀DNA分子。此時應當上下顛倒輕輕混勻，以避免産生小分子質量的基因組DNA片段，最後汙染提取的質粒DNA。
【思考題】
(1) 質粒的基本性質有哪些？
(2) 堿法提取質粒的原理是什麼?
(3) 在堿法提取質粒DNA操作過程中應注意哪些問題？
【試劑配方】
1�比芤孩瘢℅ET緩衝液）
Tris�睭Cl25mmol/L
EDTA10mmol/L
葡萄糖50mmol/L
pH8��0
2�比芤孩潁ū湫砸海�
NAOH200mmol/L
SDS1%
配製1ml溶液Ⅱ：取10% SDS 50μl、1mol/L NAOH 200μl，用滅菌去離子水定容至1ml，充分混勻，現用現配。
3�比芤孩�
醋酸鉀3mol/L
pH4��8
4�� 6×DNA上樣緩衝液
溴酚藍0��25%
蔗糖水溶液40%（W/V）
5�� 5×TBE儲存液
Tris堿1��1mol/L
硼酸900mmol/L
EDTA25mmol/L
pH8��0
6�� TE緩衝液
Tris�睭Cl10mmol/L
EDTA1mmol/L
pH8��0

（劉偉林旭）
實驗二DNA限製性內切酶酶切及迴收
【實驗目的】
(1) 掌握DNA酶切技術的原理，熟悉雙酶切反應。
(2) 掌握瓊脂糖凝膠電泳迴收DNA片段的基本原理和操作方法。
【實驗原理】
Ⅱ型限製性內切酶是分子生物學研究中經常使用的工具酶，它能識彆和切割雙鏈DNA分子中某一段特定序列的核苷酸。有的限製性內切酶在雙鏈DNA兩條鏈正好相對的位置上切割産生平末端，另一些限製性內切酶在兩條鏈上交錯切割，産生黏性末端。酶切反應需要一個理想的反應係統，要有Mg2+做輔助因子，並有一定的鹽離子濃度，經特定的條件反應後，産生大小不同的片段，用瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切結果。當獲得大小正確的片段需要做進一步的基因操作，可切取含該DNA片段的凝膠，利用核酸在緩衝液中與矽膠膜特異結閤，在洗脫液條件下可被洗脫，得到純化的目的DNA。
【實驗材料】
純化的質粒DNA，限製性內切酶KpnⅠ、XhoⅠ，10×限製性內切酶緩衝液(10×Buffer)，10×牛血清白蛋白(10×BSA)，瓊脂糖，雙蒸水（ddH2O），DNA 標準分子質量，6×DNA上樣緩衝液，1×TBE電泳緩衝液，0��5ml 微量離心管，冰盒，手術刀片，膠迴收試劑盒[溶液Ⅰ（溶膠液）、溶液Ⅱ（洗滌液）、DNA純化柱、廢液收集管]。
【實驗儀器】
恒溫水浴箱，電泳儀，水平式凝膠電泳槽，紫外透視儀，移液器，颱式離心機。
【實驗方法】
1�彼�酶切反應如果外源DNA片段插入位點兩端的酶切位點不同時，需進行雙酶切反應。在可能的情況下，通常選擇在同一反應體係下進行雙酶切。反應體係可參照下例：
ddH2O10μl
10×BSA2μl
10×Buffer2μl
KpnⅠ0��5μl
XhoⅠ0��5μl（1~2mg）
純化的質粒DNA5μl

總計20μl
37℃水浴，酶切2h，進行電泳分析。
2�鼻碇�糖凝膠迴收DNA片段
(1) 切下含DNA的凝膠塊，放入1��5ml 微量離心管。
(2) 加入300μl 溶液Ⅰ，65℃水浴10min，2min顛倒混勻一次，使膠完全融化。
(3) 混閤液轉移至已套入收集管的吸附柱內，室溫放置2min，10 000g離心1min。
(4) 棄去收集管中的廢液，將吸附柱放入同一收集管中，加500μl 溶液Ⅱ，10 000g離心1min。
(5) 重復步驟(4)。
(6) 倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入同一個收集管中，10 000r/min空柱離心2min。
(7) 將吸附柱放入一乾淨的1��5ml的EP管中，室溫放置2min使乙醇揮發，在吸附柱中膜的中央加入20μl 65℃預熱的雙蒸水進行洗脫，室溫靜置3min，10 000g離心1min，離心管中即為迴收的DNA片段。
【結果分析】
結果分析見圖1��3。
圖1��3質粒酶切示意圖
【注意事項】
(1) 反應體係中甘油終濃度必須小於5%，防止抑製酶活性（由於商品化的Ⅱ型限製性內切酶含50%甘油，因此需稀釋10倍以上）。
(2) 各Ⅱ型限製性內切酶的最佳作用溫度不盡相同，使用前務必查看說明書。
【思考題】
DNA片段酶切後産生的切口類型有幾種？

（丁亞蘭陳婉南）
實驗三DNA轉化及重組子的篩選和鑒定
體外重組後的DNA分子，需按照一定的方式導入宿主細胞。轉化（trAnsformAtion）指質粒DNA或以它為載體構建的重組子導入宿主細胞的過程。受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法、CACl2等化學試劑法）處理後，使細胞膜的通透性發生變化，成為能容許外源DNA分子通過的感受態細胞。進入細胞的DNA分子通過復製、錶達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞齣現新的遺傳性狀。本實驗以CACl2化學試劑法介紹感受態的製備及轉化。
【實驗目的】
(1) 掌握轉化的基本原理及操作步驟。
(2) 掌握重組子的篩選和鑒定的原理和方法。
【實驗原理】
大腸杆菌的轉化常用化學法（CACl2法），該法最先由Cohen於1972年建立。其原理是細菌處於0℃及0��1mmol/L CACl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混閤物中的DNA形成抗DNAse的羥基�哺屏姿岣春銜鑣じ接諳赴�錶麵，經42℃ 2min熱衝擊處理，促使細胞吸收DNA復閤物，在豐富培養基上生長數小時後，球狀細胞復原並分裂增殖，被轉化的細菌中，重組子中基因得到錶達，在選擇性培養基平闆上，可選齣所需的轉化子。常用的篩選方法有抗生素篩選、插入失活篩選、藍白斑篩選等，本實驗利用藍白斑篩選來獲得重組子。
藍白斑篩選基於α�不ゲ瓜窒螅�其基本原理為：某些載體（如pUC係列載體）帶有β�舶肴樘擒彰福↙AcZ）α�搽模∟端146個氨基酸）的編碼區，區內具有多剋隆位點，與此相對應的含LAcZ△M15基因型的菌株（LAcZ △M15基因由噬菌體介導整閤至菌株染色體上，常用菌株有E.coil Top10及DH5α）編碼LAcZ C端300個氨基酸。正常情況下，載體轉化至宿主菌後，在誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）誘導下，載體産生α-肽，與宿主産生端300個氨基 酸結閤形成具有完整活性的LAcZ，能夠將底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（X-GAl）代謝為藍色産物,使菌落呈藍色。而在重組載體中，外源DNA片段破壞α-肽編碼區，重組載體轉 至相應宿主菌後産生無活性α-肽，與宿主産物不能形成有活性的LAcZ，因此，X-GAl不被降 解，形成半透明菌落(即通常所說的白色菌落，為大腸杆菌正常的菌落形態)。因此，隻要通 過觀察菌落顔色即可判斷是否為含外源DNA片段的重組載體。
【實驗材料】
1.5ml微量離心管，培養皿，塗布棒，酒精燈，含氨苄西林LB瓊脂平闆，LB液體培養基， 新鮮配製高壓滅菌的0.1mmol/L CACl2溶液，重組質粒DNA，IPTG, X-GAl。
【實驗方法】
(1)接種E.coil DH5α單菌落細菌於5ml LB培養基。
⑵取細菌，按1:100接種於5Ml L培養基，搖育3h（對數生長期，OD600=0-4~0.6）
(3)取1mL細菌，冰浴30min。
(4）4℃，2500g離心5min。
(5）棄上清，沉澱加1mL 0.1mol/L（冰預冷），輕柔地重懸細菌,冰浴30min。
（6）4℃，2500g離心5min。
（7）棄上清，加入2000μL冰CACl2輕柔地重懸細菌。

前言/序言

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