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內容簡介

　　《現代生化技術（第三版）》是在1996年華南理工大學齣版社齣版的《現代生化技術》和2005年科學齣版社齣版的《現代生化技術》(第二版)的基礎上，根據國內外生化技術的*新進展和發展趨勢，結閤作者的教學和科研實踐，修改、補充而成。主要介紹重要而又常用的各種現代生化技術的技術原理和操作要點。內容包括三篇共15章，**篇為生化分離技術，包括提取與沉澱分離技術、過濾與膜分離技術、萃取分離技術、層析分離技術、電泳技術、離心分離技術6章；第二篇為生化檢測技術，包括化學檢測技術、光學檢測技術、酶學檢測技術、氣體檢測技術、生物檢測技術、放射性同位素檢測技術6章；第三篇為酶、基因和細胞操作技術，包括酶操作技術、基因操作技術、細胞操作技術3章。每一章都有一節列齣若乾實驗，可供選擇使用。
　　《現代生化技術(第3版普通高等教育十二五規劃教材)》可供高等院校生物技術、生物工程、生物科學、生物化工、發酵工程、酶工程、生物製藥，以及其他有關學科的本科生和研究生作為教材使用，也可供有關專業的教學工作者、科研工作者和工程技術人員參考使用。

目錄

第三版前言
第二版前言
第一版前言
第一篇生化分離技術
第一章提取與沉澱分離技術
第一節細胞破碎
一、機械破碎法
二、物理破碎法
三、化學破碎法
四、酶促破碎法
第二節提取
一、提取的方法
二、影響提取的因素
第三節沉澱分離
一、鹽析沉澱法
二、等電點沉澱法
三、有機溶劑沉澱法
四、復閤沉澱法
五、金屬鹽沉澱法
六、選擇性變性沉澱法
第四節實驗
實驗1-1大腸杆菌細胞的超聲波破碎
實驗1-2枯草杆菌堿性磷酸酶的提取與鹽析
實驗1-3枯草杆菌DNA的提取與分離
實驗1-4酵母RNA的提取與分離
實驗1-5大蒜細胞SOD的提取與分離
實驗1-6大鼠肝rRNA的提取與分離
第二章過濾與膜分離技術
第一節非膜過濾
一、非膜過濾的分類
二、非膜過濾的操作過程
第二節膜分離技術
一、膜分離的分類
二、膜分離的操作過程及其控製
第三節實驗
實驗2-1胰凝乳蛋白酶的透析脫鹽
實驗2-2糖化酶的超濾分離
第三章萃取分離技術
第一節有機溶劑萃取
一、有機溶劑的選擇
二、有機溶劑萃取的操作過程
第二節雙水相萃取
一、雙水相萃取的原理
二、雙水相萃取的操作過程
第三節超臨界萃取
一、超臨界萃取的原理
二、超臨界萃取的操作過程
第四節反膠束萃取
一、反膠束萃取的原理
二、反膠束萃取的操作過程
第五節實驗
實驗3-1青蒿素的超臨界萃取分離
實驗3-2人生長激素的雙水相萃取分離
實驗3-3穿心蓮內酯的有機溶劑萃取
第四章層析分離技術
第一節吸附層析
一、吸附層析原理
二、吸附柱層析
三、聚酰胺薄膜層析
四、其他吸附層析
第二節分配層析
一、紙層析
二、薄層層析
三、氣相層析
第三節離子交換層析
一、離子交換劑的選擇與處理
二、離子交換層析的操作過程
第四節凝膠層析
一、凝膠層析的基本原理
二、凝膠的選擇與處理
三、凝膠層析操作過程
第五節親和層析
一、親和層析母體和配基
二、親和層析方法
第六節層析聚焦
一、交換劑和緩衝液體係
二、pH梯度的形成
三、層析聚焦的操作過程
……
第二篇生化檢測技術
第三篇酶、基因和細胞操作技術

精彩書摘

　　第一章提取與沉澱分離技術生化物質種類繁多，主要包括各種蛋白質、多肽、氨基酸、核酸、核苷酸、多糖、寡糖、二糖、單糖、脂類、脂肪酸及各種初級代謝物和次級代謝物等。為瞭研究各種生化物質的分子結構、功能和各種特性，進行生物科學和生物工程的基礎與應用研究，就必須獲得高純度、具有完整結構和生物活性的各種生化物質，特彆是各種生物大分子，如蛋白質、核酸、酶等。為此，首先要從生物體的組織、器官、細胞中將它們提取齣來，然後再用沉澱分離等各種分離技術進行分離純化。本章主要介紹各種生化物質的提取與沉澱分離技術。第一節細胞破碎生物體內的各種物質種類繁多，存在於生物體的不同部位。除瞭動物、植物體液中和微生物細胞胞外的某些蛋白質和多肽之外，大多數生物大分子都存在於細胞內部。為瞭獲得細胞內的各種生化物質，就得收集組織、細胞並進行組織或細胞破碎，破壞細胞的外層結構，纔能進行生化物質的提取和分離純化。不同的生物體，或同一生物體不同組織的細胞，由於結構不同，所采用的細胞破碎方法和條件不同。必須根據具體情況進行適當的選擇，以達到預期的效果。細胞破碎方法很多，可以分為機械破碎法、物理破碎法、化學破碎法和酶促破碎法等。在實際使用時應當根據細胞的特性、生化物質的特性等具體情況選用適宜的細胞破碎方法。有時也可以采用2種或2種以上的方法聯閤使用，以便達到細胞破碎的效果，又不會影響酶的活性。一、機械破碎法通過機械運動産生的剪切力的作用，使細胞破碎的方法稱為機械破碎法。常用的破碎機械有組織搗碎機、細胞研磨器、勻漿器等。按照所使用破碎機械的不同，機械破碎法可以分為搗碎法、研磨法和勻漿法3種。1�鋇匪櫸ɡ�用搗碎機的高速鏇轉葉片所産生的剪切力將組織或細胞破碎的方法稱為搗碎法。搗碎機的轉速可以高達10000r/min。此法常用於動物內髒、植物葉芽等比較脆嫩的組織或細胞的破碎，也可以用於微生物，特彆是細菌的細胞破碎。使用時，先將組織、細胞懸浮於水或其他介質中，置於搗碎機內進行破碎。2�毖心シɡ�用研鉢、石磨、細菌磨、球磨等研磨器械所産生的剪切力將組織或細胞破碎的方法稱為研磨法。必要時可以加入精製石英砂、小玻璃球、玻璃粉、氧化鋁等作為助磨劑，以提高研磨效果。研磨法設備簡單，可以采用人工研磨也可以采用電動研磨。其中，電動球磨機可以在實驗室也可以在工業生産中使用。此法常用於微生物和植物組織或細胞的破碎。3�痹冉�法利用勻漿器産生的剪切力將組織或細胞破碎的方法稱為勻漿法。勻漿器一般由硬質磨砂玻璃製成，也可以由硬質塑料或不銹鋼等製成。勻漿器由一個內壁經磨砂的管和一根錶麵經磨砂的研杆組成，管和研杆必須配套使用，研杆與管壁之間僅有幾百微米的間隙。通常用於破碎那些易於分散、比較柔軟、顆粒細小的組織或細胞。大塊的組織或者細胞團需要先用組織搗碎機或研磨器械搗碎分散後纔能進行勻漿。勻漿器的細胞破碎程度較高，對酶的活力影響不大，但處理量較少。高壓勻漿器可在工業化生産中應用。二、物理破碎法通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素的作用，使組織或細胞破碎的方法，稱為物理破碎法。物理破碎法多用於微生物細胞的破碎。常用的物理破碎法有溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法等，現簡介如下。1�蔽露炔釔撲櫸ɡ�用溫度的突然變化，細胞由於熱脹冷縮的作用而破碎的方法稱為溫度差破碎法。例如，將在-18℃冷凍的細胞突然放進熱水中，或者將較高溫度的熱細胞突然冷凍，都可以使細胞破壞。溫度差破碎法對於那些較為脆弱、易於破碎的細胞，如革蘭氏陰性菌等，有較好的破碎效果。但是在提取酶時，不能在過高的溫度下操作，以免引起酶的變性失活。此法難以工業化生産。2�毖沽Σ釔撲櫸ㄍü�壓力的突然變化，使細胞破碎的方法稱為壓力差破碎法。常用的有高壓衝擊法、突然降壓法及滲透壓變化法等。（1）高壓衝擊法是在結實的容器中裝入細胞和冰晶、石英砂等混閤物，然後用活塞或衝擊錘施以高壓衝擊，衝擊壓力可達50～500MPa，從而使細胞破碎。（2）突然降壓法是將細胞懸浮液裝進高壓容器，加高壓至30MPa甚至更高，打開齣口閥門，使細胞懸浮液迅速流齣，齣口處的壓力突然降低到常壓，細胞迅速膨脹而破碎。突然降壓法又稱為爆炸式降壓法，是將細胞懸浮液裝入高壓容器，通入氮氣或二氧化碳，加壓到5～50MPa，振蕩幾分鍾，使氣體擴散到細胞內，然後突然排齣氣體，壓力驟降，使細胞破碎。突然降壓法對細胞的破碎效果取決於下列幾個因素。①壓力差：一般壓力差要達到3MPa以上，纔有較好的破碎效果。②壓力降低速率：壓力降低得越快，破碎效果越好，壓力若在瞬間驟降，可以達到爆炸性效果。③細胞的種類和生長期：此法對大腸杆菌等革蘭氏陰性菌的破碎效果較佳，最好使用對數生長期的細胞。（3）滲透壓變化法是利用滲透壓的變化使細胞破碎。使用時，先將對數生長期的細胞分離齣來，懸浮在高滲透壓溶液(如20%左右的蔗糖溶液等)中平衡一段時間。然後離心收集細胞，迅速投入4℃左右的蒸餾水或其他低滲溶液中，由於細胞內外的滲透壓差彆而使細胞破碎。此法特彆適用於膜結閤酶、細胞間質酶等的提取。但是對革蘭氏陽性菌不適用，主要是由於革蘭氏陽性菌的細胞壁由肽多糖組成，可以承受滲透壓的變化而不緻細胞破裂。3�背�聲波破碎法利用超聲波發生器所發齣的10～25kHz的聲波或超聲波的作用，使細胞膜産生空穴作用(cavitation)而使細胞破碎的方法稱為超聲波破碎法。超聲波破碎的效果與輸齣功率、破碎時間有密切關係。同時受細胞濃度、溶液黏度、pH、溫度及離子強度等的影響，必須根據細胞的種類和酶的特性加以選擇。超聲波細胞破碎的一般操作條件為：頻率10～20kHz；輸齣功率100～150W；溫度0～10℃；pH4～7；處理時間3～15min；為瞭減少發熱，防止溫度升高對酶産生不利影響，可以在冷庫中進行操作，或者將樣品置於冰浴中，並采用間歇操作，如破碎30～60s，間歇1min，如此反復進行。超聲波破碎具有簡便、快捷、效果好等特點，特彆適用於微生物細胞的破碎。最好采用對數生長期的細胞。三、化學破碎法通過各種化學試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎的方法稱為化學破碎法。常用的化學試劑有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有機溶劑，以及特裏頓(Triton)、吐溫(Tween)等錶麵活性劑。有機溶劑可以使細胞膜的磷脂結構破壞，從而改變細胞膜的透過性，使細胞內物質釋放到細胞外。為瞭防止酶變性失活，操作時應當在低溫條件下進行。錶麵活性劑可以和細胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使細胞膜結構破壞，從而增加細胞膜的透過性。錶麵活性劑有離子型和非離子型之分，離子型錶麵活性劑對細胞破碎的效果較好，但會破壞酶的空間結構，從而影響酶的催化活性。所以在酶的提取方麵，一般采用非離子型的錶麵活性劑，如Tween、Triton等。四、酶促破碎法通過細胞本身的酶係或外加酶製劑的催化作用，使細胞外層結構受到破壞，而達到破碎細胞目的的方法稱為酶促破碎法，或稱為酶學破碎法。利用細胞本身酶係的作用，在一定pH和溫度條件下，保溫一段時間，使細胞破壞，而使細胞內物質釋齣的方法稱為自溶法。自溶法效果的好壞取決於溫度、pH、離子強度等自溶條件的選擇與控製。為瞭防止其他微生物在自溶細胞液中生長，可以添加少量的甲苯、氯仿、疊氮鈉等防腐劑。根據細胞外層結構的特點，還可以外加適當的酶作用於細胞，使細胞壁受到破壞，並在低滲透壓的溶液中，使細胞破裂。例如，革蘭氏陽性菌主要依靠肽多糖維持細胞壁的結構和形狀，外加溶菌酶，作用於肽多糖的β��1，4�蔡擒占�，而使其細胞壁破壞；酵母細胞的破碎是外加β�財暇厶敲福�使其細胞壁的β��1，3�財暇厶撬�解；黴菌可用幾丁質酶進行細胞破碎；縴維素酶、半縴維素酶和果膠酶的混閤使用，可使各種植物的細胞壁受到破壞，對植物細胞有良好的破碎效果。在酶催化過程中，要根據細胞壁的結構特點選擇使用適當的酶，並根據酶的動力學性質，控製好各種催化條件。第二節提取提取是指在一定的條件下，用適當的溶劑(溶液)處理原料，使欲分離的生化物質充分溶解到溶劑(溶液)中的過程，也稱為抽提。影響提取的主要因素是欲提取物質在所使用的溶劑(溶液)中的溶解度，以及該物質嚮溶劑(溶液)擴散的速率。一種物質在某一溶劑或溶液中的溶解度大小與該物質的分子結構及所使用的溶劑的理化性質有密切關係。一般來說，極性物質易溶於極性溶劑中，非極性物質易溶於非極性有機溶劑中，酸性物質易溶於堿性溶劑中，堿性物質易溶於酸性溶劑中。提取條件對提取效果也有顯著影響。通常隨著溫度升高，生化物質的溶解度增大。在不同的pH條件下，各種生化物質的溶解度各不相同，對於兩性電解質而言，在pH為等電點時，溶解度最小。從細胞、細胞碎片或其他原料中提取蛋白質的過程還受到擴散作用的影響。為瞭提高提取率並防止生化物質(特彆是蛋白質和核酸)的變性失活，在提取過程中還要注意控製好溫度、pH等提取條件。一、提取的方法根據提取時所采用的溶劑或溶液的不同，提取方法主要有鹽溶液提取、酸溶液提取、堿溶液提取和有機溶劑提取等。現以蛋白質和核酸的提取為例，簡單介紹如下。1�毖穩芤禾崛〈蠖嗍�蛋白質都溶於水，而且在低濃度鹽存在的條件下，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現象。而在鹽濃度達到某一界限後，蛋白質的溶解度隨鹽濃度升高而降低，這稱為鹽析現象。所以，一般采用稀鹽溶液進行蛋白質的提取，鹽的濃度一般控製在0��02～0��5mol/L的。例如，固體發酵生産的麩麯中的澱粉酶、蛋白酶等胞外酶，用0��14mol/L的氯化鈉溶液或0��02～0��05mol/L的磷酸緩衝液提取；酵母醇脫氫酶用0��5mol/L的磷酸氫二鈉溶液提取；6�擦姿崞鹹煙峭亞餉贛�0��1mol/L的碳酸鈉溶液提取；枯草杆菌堿性磷酸酶用0��1mol/L的氯化鎂溶液提取等。有少數酶，如黴菌脂肪酶，用不含鹽的清水提取的效果較好。核糖核酸(RNA)除瞭常見的轉移核糖核酸(tRNA)、信使核糖核酸(mRNA)和核糖體核糖核酸(rRNA)外，還有各種小分子核糖核酸(sRNA)。RNA可以采用稀鹽溶液提取。一般在細胞破碎製成勻漿後，采用0��14mol/L的氯化鈉溶液抽提，再與蛋白質、多糖、少量脫氧核糖核蛋白等分離而得到RNA。脫氧核糖核酸(DNA)主要存在於細胞核中，通常以脫氧核糖核蛋白的形式存在。DNA可以采用濃鹽溶液提取。一般在細胞破碎製成勻漿後，先用0��14mol/L的氯化鈉抽提除去RNA，再用1mol/L的氯化鈉溶液提取脫氧核糖核蛋白，然後與含有少量辛醇或戊醇的氯仿一起振蕩除去蛋白質而得到DNA。2�彼崛芤禾崛∮行┥�化物質在酸性條件下溶解度較大，且穩定性較好，宜用酸溶液提取。提取時要注意溶液的pH不能太低，即酸的濃度不能太高，以免發生變性失活現象。通常選用pH為3～6進行蛋白質的提取，如胰蛋白酶可用0��12mol/L的硫酸溶液提取等。3�奔釗芤禾崛∮行┰詡鈈蘊跫�下溶解度較大且穩定性較好的蛋白質，應采用堿溶液提取。例如，細菌L�蔡於�酰胺酶可用pH11～12��5的堿溶液提取。操作時要注意pH不能過高，以免影響酶的活性。同時，在加堿液的過程中要一邊攪拌一邊緩慢加進，以免齣現局部過堿現象，而引起蛋白質的變性失活。4�庇謝�溶劑提取有些與脂質結閤牢固或含有較多非極性基團的蛋白質，可以采用與水可以混溶的乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑提取。例如，琥珀酸脫氫酶、膽堿酯酶、細胞色素氧化酶等采用丁醇提取；植物種子中的醇溶榖蛋白采用70%～80％的乙醇提取；胰島素可以采用60%～70％的酸性乙醇提取等。RNA和DNA可以采用苯酚水溶液提取，即在細胞破碎製成勻漿後，加入等體積的90％苯酚水溶液，在一定的條件下振蕩一定時間，靜止分層後，DNA和蛋白質沉澱於苯酚層中，經過進一步純化，除去蛋白質，得到DNA；RNA和多糖溶解於水層中，經分離除去多糖，得到RNA。提取時的操作溫度通常為2～5℃，稱為冷酚法提取，也可以在60℃左右，進行熱酚法提取。二、影響提取的因素在生化物質的提取過程中，受到各種外界條件的影響。其中主要影響因素是生化物質的溶解度以及生化物質嚮溶劑相擴散速率，同時受溫度、pH、提取液體積等提取條件的影響。1�比芙舛壬�化物質大多數屬於極性物質，易溶於極性溶劑中。例如，大多數蛋白質、核酸、糖類等可以采用水溶液提取。然而脂類和某些與脂質結閤牢固或分子中含有較多的非極性基團的蛋白質等，易溶於有機溶劑，可以采用有機溶劑提取。2�崩┥⑺俾噬�化物質分子從原料溶解到溶劑(溶液)的過程是一種擴散過程，其擴散速率直接關係到提取效果，擴散速率越大，提取效果越好。生化物質在溶劑中的擴散速率與溫度、黏度、擴散麵積、擴散距離及兩相間的濃度差有密切關係。一般來說，提高溶液溫度、降低溶液黏度、增加擴散麵積、減少擴散距離、增大兩相界麵的濃度差，都有利於提高擴散速率，從而增強提取效果。3�蔽露忍崛∈鋇奈露榷蘊崛⌒Ч�有明顯影響。一般來說，適當提高溫度，可以提高生化物質的溶解度，也可以增大分子的擴散速率，但是溫度過高，會引起蛋白質、核酸等分子的變性失活。特彆是采用有機溶劑提取時，應控製在0～10℃的低溫條件下。有些生化物質對溫度的耐受性較好，可在室溫或更高一些的溫度條件下提取，如酵母醇脫氫酶、細菌堿性磷酸酶、胃蛋白酶等。在不影響酶活性的條件下，適當提高溫度，有利於生化物質的提取。4�眕H溶液的pH對蛋白質等兩性電解質的溶解度和穩定性有顯著影響。兩性電解質分子中含有各種可離解基團。在一定條件下，有的可以離解為陽離子，帶正電荷；有的可以離解為陰離子，帶負電荷。在某一個特定的pH條件下，分子上所帶的正、負電荷相等，淨電荷為零，此時的pH即為該分子的等電點。在等電點的條件下，兩性電解質分子的溶解度最小。不同的兩性電解質分子有其各自不同的等電點。為瞭提高兩性電解質的溶解度，提取時pH應該避開其等電點，以提高其溶解度，但是溶液的pH不宜過高或過低，以免引起蛋白質等分子的變性失活。5�碧崛∫禾寤�增加提取液的用量，可以提高生化物質的提取率，但是過量的提取液，會使生化物質的濃度降低，對進一步的分離純化不利，所以提取液的總量一般為原料體積的3～5倍，最好分幾次提取。此外，在生化物質的提取過程中，原料的顆粒體積越小，則擴散麵積越大，有利於提高擴散速率；適當的攪拌可以使提取液中分子迅速離開原料顆粒錶麵，從而增大兩相界麵的濃度差，有利於提高擴散速率；適當延長提取時間，可以使更多的生化物質溶解齣來，直至達到平衡。在提取過程中，為瞭提高生化物質的穩定性，以免引起變性失活，可適當加入某些保護劑。例如，在酶的提取過程中，適當加入酶作用的底物、輔酶、某些抗氧化劑等，都可以提高酶的穩定性。第三節沉澱分離沉澱分離是通過改變某些條件或添加某種物質，使某溶質在溶液中的溶解度降低，從溶液中沉澱析齣，而與其他溶質分離的技術過程。
　　……

前言/序言

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